1.配制

標(biāo)記緩沖液：0.2M NaHCO3  (pH=9.0)；
標(biāo)記終止緩沖液： 10% 賴氨酸  0.2M NaHCO3  (pH=9.0)溶液；
脫鹽純化緩沖液：0.1M Na2HPO4-NaH2PO4  (pH=6.5)；
德晟吖啶酯激發(fā)A： 0.1% H2O2 ，0.1M HNO3。激發(fā)液B：0.2M NaOH，2%Trinon-100

2. 計(jì)算標(biāo)記所用抗體（蛋白質(zhì)）和吖啶酯的量

通常設(shè)定摩爾比n(抗體): n(吖啶酯)=1:10~1:50，具體需根據(jù)氨基酸組分進(jìn)行摸索調(diào)整；
配制2.5mg/ml 德晟吖啶酯-DMSO母液，注意玻璃器皿盛放并避光；
使用0.2M NaHCO3（pH=9.0） 溶液配制0.1~0.5 mg/ml 抗體反應(yīng)液

3. 連接及純化

本說(shuō)明書(shū)舉例針對(duì)標(biāo)記抗體抗體的分子量為 180Kd 對(duì)應(yīng) 15 倍的德晟吖啶酯。如果用戶的待標(biāo)記樣品是其他的分子量，請(qǐng)參考附表 1 改變?cè)噭┑呐浔?/span>；

取 10 μL 稀釋吖啶酯母液 (2.5mg/ml)，加入 90 μL 無(wú)水 DMSO(or DMF) 稀釋10倍，配成吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)；

使用0.2M NaHCO3(pH=9.0)溶液稀釋 50μg 的抗體至 300 μL，加入 10 μL吖啶酯工作液 (0.25mg/ml)（參考附表 1）；

錫箔紙包好，室溫標(biāo)記0.5~1h；

淬滅反應(yīng)，加入 100 μL 標(biāo)記終止緩沖液，室溫混勻 30 分鐘（注：如果標(biāo)記較充分，也可以跳過(guò)此步驟，直接進(jìn)行柱純化）；

脫鹽柱純化，收集吖啶標(biāo)記蛋白組分并檢測(cè)濃度，請(qǐng)參考說(shuō)明書(shū)后文；

檢測(cè)標(biāo)記的蛋白，取10μL吖啶標(biāo)記蛋白，放于黑色96孔板中，向每個(gè)微孔注入 50 μL吖啶酯激發(fā)液A，1秒后，自動(dòng)加入50μL激發(fā)液B，立即檢測(cè)，如果發(fā)光過(guò)強(qiáng)，可以對(duì)標(biāo)記蛋白再進(jìn)行若干倍的稀釋，使其在儀器的發(fā)光檢測(cè)限內(nèi)；

德晟吖啶酯標(biāo)記的蛋白可以在酸性緩沖液中4℃避光存儲(chǔ)（注意補(bǔ)加疊氮鈉等防腐劑），如果儲(chǔ)存效果不佳，則請(qǐng)避光保存于-20℃或者-80℃；

注意事項(xiàng)

吖啶酯除了DMF，也可以用無(wú)水DMSO等非質(zhì)子性溶劑來(lái)溶解。通常德晟吖啶酯用DMF高溶解的濃度為4mM (約2.7mg/ml)，我司生產(chǎn)的吖啶酯中DMSO中溶解度可達(dá)10mg/ml。

標(biāo)記前，由于吖啶酯末端羧基經(jīng)NHS活化,較為活潑，請(qǐng)用非質(zhì)子性的干燥無(wú)水溶劑來(lái)溶解；標(biāo)記后，標(biāo)記后吖啶酯與被標(biāo)記物之間以酰胺鍵或者酯鍵等形式存在，酸性溶劑基本沒(méi)有影響；吖啶酯本身活性位點(diǎn)在堿性和氧化環(huán)境下不穩(wěn)定，因此應(yīng)根據(jù)被標(biāo)記物的穩(wěn)定性配制相應(yīng)的非強(qiáng)堿性非氧化的體系中處理和保存。

發(fā)光標(biāo)記物在光照條件下有可能部分分解，以致影響發(fā)光效果。吖啶酯的實(shí)驗(yàn)操作和儲(chǔ)存建議避光條件下處理，目前暫時(shí)沒(méi)有具體的研究數(shù)據(jù)。

吖啶酯標(biāo)記蛋白等大分子化合物建議用G25脫鹽柱分離；吖啶酯標(biāo)記小分子化合物建議用柱層析分離;