化學(xué)發(fā)光試劑吖啶酯有很多類型,一般統(tǒng)稱吖啶酯類,還包括吖啶鹽、吖啶磺酰胺、吖啶羧酸等,那么它們之間有什么區(qū)別呢?
目前德晟研發(fā)的吖啶酯類化學(xué)發(fā)光試劑共有六種,分別在傳統(tǒng)吖啶酯的基礎(chǔ)上進(jìn)行了官能團(tuán)的取代,在發(fā)光性能、穩(wěn)定性和便于標(biāo)記蛋白、抗體方面做了優(yōu)化改性。傳統(tǒng)吖啶酯及六種新型吖啶酯如下:
0# AE-NHS
1# DMAE-NHS
2# Me-DMAE-NHS
3# NSP-DMAE-NHS
4# NSP-SA-NHS
5# NSP-SA
6# NSP-SA-ADH
抗水解性不同:
傳統(tǒng)吖啶酯0#(AE-NHS),1~3#在其結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了修飾,增大了位阻,增強(qiáng)了抗水解性。0#只在酸性溶液中穩(wěn)定,當(dāng)pH值大于6.3后易水解,而1~3#則不然,如在室溫下,在pH為7.0的PB緩沖液中很穩(wěn)定,16天后,發(fā)光活性只降低3.6%。
穩(wěn)定性不同:
4#、5#、6#吖啶酯則是引入了磺酰胺基團(tuán),其穩(wěn)定性較吖啶酯類(0#、1#、2#、3#)高,其原因是由于C-N鍵與C-O鍵的鍵級(jí)不同,C-N鍵大于C-O鍵。吖啶酰胺類化合物(4~6#)抵抗水解的能力也強(qiáng)于吖啶酯類(0~3#)化合物。4~6#在酸性溶液中(pH<4.8)都很穩(wěn)定,與蛋白質(zhì)偶聯(lián)物在室溫下保存4周,其光量子產(chǎn)率不降低,凍干品在-20℃下,可以保存一年以上。
發(fā)光原理相同,離去基團(tuán)不同:
吖啶酯和吖啶磺酰胺的反應(yīng)機(jī)理是相同的,只是離去基團(tuán)不團(tuán)。在堿性條件下,過氧化氫與吖啶的9位碳原子發(fā)生加成,加成產(chǎn)物在堿性條件下形成的過氧負(fù)離子再親核進(jìn)攻羰基碳,離去基團(tuán)離去并進(jìn)一步形成不穩(wěn)定的四元環(huán)中間體1,2-二氧雜環(huán)丁烷酮,開環(huán)后形成激發(fā)態(tài)的吖啶酮,其返回到基態(tài)的過程中釋放出光子,波長為470nm。吖啶酯和吖啶磺酰胺的離去基團(tuán)分別為-OR和-NR(SO2R),當(dāng)離去基團(tuán)上R3,R4為給電子基團(tuán)時(shí)(如R3,R4 =CH3),能起到增大空間位阻的同時(shí)降低羰基親電性。
吖啶酯發(fā)光原理
除了上述幾點(diǎn)外,不同吖啶酯的親水性也有差異,另外離去基團(tuán)上不同的R基團(tuán)也是的它們的表及方法有差異,需要根據(jù)所標(biāo)記的蛋白、抗體來作選擇。